Indicazioni generali per l'uso di superfici con gruppi carbossilici ed amminici per test immunologici

La biomat ha sviluppato delle superfici in polistirene modificato introducendo gruppi chimici quali NH/NH₂ e COOH.

Questi gruppi sono in grado di legare alla superficie plastica vari composti con legami di tipo covalente.
Le proprietà ottiche del polistirene rimangono inalterate, permettendo l'utilizzo di queste superfici modificate come un potente strumento nei test diagnostici.

Queste superfici offrono la possibilità di:

• immobilizzare in modo covalente piccole molecole che altrimenti si legherebbero debolmente o per nulla attraverso l'adsorbimento fisico
• orientare in modo definito le molecole immobilizzate sulla fase solida

Qui di seguito vengono illustrati alcuni esempi di applicazioni per fornire delle linee guida che permettano agli utilizzatori di sviluppare i loro propri test bio-specifici .

1. Legame di composti attivati con NHS

Un'applicazione molto semplice e facile delle superfici biomat NH/NH₂ è il legame di molecole che sono state attivate per esterificazione con derivati dell' N-hydroxysuccinimide (NHS). Nel nostro esperimento la biotina esterificata con n-Hydroxysuccinimide si lega immediatamente attraverso i suoi gruppi carbonilici ai gruppi amminici della superficie , come dimostrato nella figura 1.

Preparazione dei reagenti e tamponi

Materiali

Fase solida:	piastre biomat	MT02F-AM1 (gruppi amminici primari) MT02F-AM2 (gruppi amminici secondari) MT01F-HB (alta capacità legante)
-Caproylamido-biotin-N- hydroxysuccinimide ester (NHS- biotina)	BIO-SPA	Cat No. B002-61
Dimetilformamide (DMFO)	Fluka	Cat No. 40250
Tween® 20	Merck	Cat No. 822184
Streptavidina	BIO-SPA	Cat. No. S002-60
Streptavidina-perossidasi	BIO-SPA	Cat. No. SB01-61
BSA	Intergen	Cat. No. 3100
TMB substrato per perossidasi	Kirkegard & Perry	Cat. No. 50-76-05

Esperimento

1. Aggiungere ai pozzetti delle piastre (ammine primarie AM1 ed HB ad alta capacità legante) 100 µl delle soluzioni a 150-100-50-10 µg/ml di NHS-biotina e 0,1M PBS pH 7,2 + 0,15% Tween^® 20 come blank di reazione. Ricoprire con tape adesivo per prevenire l'evaporazione
2. Incubare overnight a temperatura ambiente
3. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0,1M PBS pH 7,2 + 0,05% Tween^® 20,
4. Aggiungere 100µl di mix di streptavidina ad ogni pozzetto ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente
5. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0,1M PBS pH 7,2 + 0,05% Tween^® 20
6. Aggiungere 100 µl di TMB ad ogni pozzetto ed incubare per 10 minuti a temperatura ambiente
7. Bloccare la reazione aggiungendo 100 µl di acido solforico 1 N e leggere la densità ottica a 450 nm.

Risultati

I risultati (vedi fig. 2) mostrano una chiara correlazione fra la concentrazione di NHS-biotina aggiunta ai pozzetti e la quantità di biotina legata alla superficie biomat NH₂.

D'altra parte, non si rileva alcuna biotina legata alla superficie priva di gruppi amminici primari (HB) , dimostrando che non avviene alcun legame di biotina nè di enzima coniugato per adsorbimento passivo.

Concludiamo pertanto che la NHS-Biotina si è legata in modo covalente ai gruppi amminici presenti sulla superficie biomat NH₂ .

Superfici amminate e carbossilate

2. Legame di apteni o peptidi aventi gruppi carbossilici alla superficie biomat NH/NH₂

Il gruppo carbossilico presente in una molecola a basso peso molecolare, come un aptene o un peptide, si lega alla superficie biomat NH/NH₂ attraverso la formazione di legami ammidici fra il gruppo carbossilico presente nella molecola e i gruppi amminici della superficie attraverso l'azione combinata della carbodiimide e l' N-hydroxysuccinimide.

La fig. 3 mostra lo schema di reazione del legame di un aptene, la biotina, alla superficie attraverso il suo gruppo carbossilico.

Preparazione dei reagenti e tamponi

Materiali

Esperimento

1. Aggiungere 50 µl di acqua distillata ad ogni pozzetto eccetto quelli nella colonna 2. Poi aggiungere 100 µl di soluzione Biotina/NHS a tutti i pozzetti nella colonna 2.
2. Diluire trasferendo 50 µl dai pozzetti della colonna 2 a quelli della colonna 3, mescolare per agitazione, trasferire 50 µl dalla colonna 3 alla colonna 4, mescolare e proseguire in questo modo fino alla colonna 12.
3. Per iniziare la reazione: aggiungere 50 µl di soluzione EDC ad ogni colonna. Nel blank (colonna 1) aggiungere 50 µl di acqua distillata al posto dell' EDC.
4. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
5. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0.1 M PBS pH 7,2 + 0.05% Tween^® 20.
6. Aggiungere 100µl di mix di streptavidina ad ogni pozzetto ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente
7. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0,1M PBS pH 7,2 + 0,05% Tween^® 20,
8. Aggiungere 100 µl di TMB ad ogni pozzetto ed incubare per 10 minuti a temperatura ambiente
9. Bloccare la reazione aggiungendo 100 µl di acido solforico 1 N e leggere la densità ottica a 450 nm

Risultati

I risultati di questo esperimento (fig. 4) mostrano chiaramente che la molecola (biotina) è rilevabile sulla superficie biomat NH₂ (cod. AM1) mentre non lo è sulla superficie biomat HB (alta capacità legante).

Questi risultati indicano che un legame covalente ha avuto luogo fra il gruppo carbossilico della biotina e l'ammina primaria presente sulla superficie biomat NH₂.

I risultati (dati non illustrati) mostrano che senza l'aggiunta di carbodiimide non avviene il legame covalente della biotina.

Superfici amminate e carbossilate

3. Legame di molecole aventi un gruppo amminico, alla superficie biomat COOH

I gruppi amminici presenti in ogni molecola, quali peptidi o proteine, si possono legare alla superficie biomat COOH attraverso la formazione di ponti ammidici fra il gruppo amminico presente nella molecola ed i gruppi carbossilici sulla superficie per azione della carbodiimide.

La fig. 6 mostra lo schema di reazione per legare un aptene, la biotin-Hydrazide, attraverso il suo gruppo amminico disponibile.

Preparazione dei reagenti e tamponi

Materiali

Esperimento

1. Aggiungere ai pozzetti (carbossilati ed HB non attivati) 100 µl delle soluzioni di biotin-hydrazide 100-50-10-1-0,5-0,25-0,1 µg/ml e 100 µl di 0,1 M MES pH 6,0 come 0 µg/ml. Sigillare i pozzetti con tape adesivo per prevenire l'evaporazione.
2. Incubare overnight a temperatura ambiente.
3. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0.1 M PBS pH 7,2 + 0.05% Tween^® 20.
4. Aggiungere 100µl di mix di streptavidina ad ogni pozzetto ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente
5. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0.1 M PBS pH 7,2 + 0.05% Tween^® 20
6. Aggiungere 100 µl di TMB ad ogni pozzetto ed incubare per 10 minuti a temperatura ambiente
7. Bloccare la reazione aggiungendo 100 µl di acido solforico 1 N e leggere la densità ottica a 450 nm

Risultati

I risultati di questo esperimento (fig. 5) mostrano chiaramente che la molecola (biotin-hydrazide) è legata in modo ben rilevabile alla superficie biomat COOH mentre non è rilevabile sulla superficie biomat HB.

I risultati indicano che un legame covalente ha avuto luogo fra il gruppo amminico della biotin-hydrazide ed il gruppo carbossilico presente sulla superficie biomat COOH.

I risultati (dati non illustrati) mostrano che senza l'aggiunta di carbodiimide non avviene il legame covalente della biotin-hydrazide.