Indicazioni generali per l'uso di superfici con gruppi maleimidici per test immunologici

La superficie derivatizzata con Maleimide lega in modo covalente i gruppi sulfidrilici resi disponibili nelle biomolecole dopo la riduzione di legami disulfidici o dopo la modificazione di ammine primarie con l'introduzione del gruppo sulfidrilico mediante attivazione chimica.

Riduzione del legame disulfidico

I legami disulfidici, presenti nelle biomolecole, sono formati dall'unione di due amminoacidi di cisteina. Questi legami sono molto stabili e conferiscono alla biomolecola una "forma di non reattività". E' possibile reattivare tali legami attraverso la loro riduzione, trasformando la forma ossidata del gruppo disulfide nella forma ridotta che sviluppa due gruppi sulfidrilici. I gruppi sulfidrilici così formati reagiscono direttamente con il gruppo maleimidico presente sulla superficie del pozzetto, dando luogo ad un legame covalente, altamente stabile.

Tra i più comuni agenti utilizzati per la riduzione del legame disulfidico (R—SH), si possono citare:

• DDT (Ditiotreitolo)
• 2-Mercaptoetanolo
• 2-Mercaptoetilammina
• S-Acetylmercaptosuccinic anhydride

Modifica di un gruppo amminico in sulfidrilico

E' possibile reattivare un gruppo amminico NH₂, presente sull'amminoacido Lisina o come porzione terminale di una biomolecola, in un gruppo sulfidrilico capace di reagire direttamente con il gruppo maleimidico presente sulla superficie del pozzetto, dando luogo ad un legame covalente, altamente stabile.

Un agente chimico comunemente utilizzato per questa reazione è il reagente di Traut, il 2-Iminotiolano cloridrato.

Reagente di Traut = AR—S

I gruppi sulfidrilici liberi, formati sia attraverso la reazione di riduzione che la reattivazione del gruppo amminico, sono instabili e possono facilmente riconvertirsi nella forma ossidata. L'addizione di reagenti chelanti quali EDTA riduce la riconversione a gruppo disulfidico.

I gruppi sulfidrilici liberi sono covalentemente immobilizzati alla superficie maleimidica secondo il seguente schema di reazione:

Procedura generale per il legame covalente di una biomolecola ad una superficie derivatizzata con Maleimide

1. Reattivare la struttura primaria della biomolecola per rendere disponibile il gruppo sulfidrilico
2. Diluire la biomolecola reattivata (campione) alla concentrazione di 0,1-10 µg/ml in 0,1 M tampone fosfato pH 6,5 + 5 mM EDTA + 0,05% Tween^® 20.
3. Aggiungere 100-200 µl di campione ad ogni pozzetto; inoltre aggiungere uguale volume di solo tampone diluente ad un pozzetto da utilizzare come controllo non specifico di reazione
4. Incubare per 1-2 h. a temperatura ambiente
5. Aspirare la soluzione dai pozzetti e lavare 4 volte con 0,1M tampone fosfato pH 7,2-7,4
6. Eseguire un postcoating per neutralizzare eventuali gruppi maleimidici rimasti attivi mediante l'utilizzo di una proteina quale non fat dry milk al 0,5%. Incubare la soluzione proteica per 1 h. a temperatura ambiente
7. Aspirare la soluzione bloccante e quindi proseguire la reazione in funzione del test prefissato

Esempio: Riduzione del legame disulfidico nelle Immunoglobuline IgG

La riduzione del legame disulfidico e la conseguente formazione di gruppi tiolici (SH) nelle Immunoglobuline IgG consente di ottenere una molecola in grado di intereagire covalentemente con gruppi maleimidici.

Preparazione dei reagenti e tamponi

• Aggiungere 0.02 ml della soluzione di anidride (punto 2.) ad 1 ml della soluzione delle IgG (punto 1.), incubare a temperatura ambiente per 30 minuti con continua agitazione.
• Preparare la soluzione al punto 3., agitare bene e portare a pH 7 con NaOH
• Aggiungere 0.04 ml della soluzione precedente alla soluzione di IgG + anidride . Agitare ed incubare la soluzione a 30 °C per 5 minuti
• Dializzare a temperatura ambiente la soluzione contro 0.1M tampone fosfato pH 6.5 contenente 5mM EDTA (punto 4.)
• Effettuare 4 cambi del tampone di dialisi ogni 30 minuti

1. Al termine della dialisi diluire la soluzione ottenuta in 0.1M tampone fosfato pH 6.5 contenente 5mM EDTA + 0,05% Tween^® 20 ottenendo delle concentrazioni a scalare da 10 µg/ml fino a 0,12 µg/ml.
2. Aggiungere ai pozzetti di una piastra con superficie derivatizzata con Maleimide 100 µl delle soluzioni ottenute ed incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Si effettua un confronto con pozzetti non trattati (MB) utilizzati come blank
3. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0,1M PBS pH 7,2 + 0,05% Tween^® 20,
4. Aggiungere 100 µl di una soluzione di AHIgG-Pod ad ogni pozzetto ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente
5. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0,1M PBS pH 7,2 + 0,05% Tween^® 20
6. Aggiungere 100 µl di TMB ad ogni pozzetto ed incubare per 10 minuti a temperatura ambiente
7. Bloccare la reazione aggiungendo 100 µl di acido solforico 1 N e leggere la densità ottica a 450 nm.