Procedura generale per il legame di una immunoglobulina
al pozzetto coattato con Proteina A

1. diluire l'immunoglobulina ( campione) alla concentrazione di 0.1-5 µg/ml in appropriato tampone a pH neutro o leggermente basico (8- 8,5)
2. procedere con un'incubazione: i tempi e la temperatura di reazione sono dipendenti dal tipo di IgG e dal suo grado di purezza
3. lavare 4 volte per rimuovere il materiale non legato
4. a questo punto è possibile proseguire il test a seconda delle esigenze dell'esperimento:
• rilevare l'immunoglobulina legata
• utilizzare l'immunoglobulina legata per rilevare / legare l'antigene specifico

Esempio di test: capacità legante verso HIgG biotinilate

1. Aggiungere ai pozzetti di una piastra coattata con Proteina A 100 µl di soluzioni di HIgG biotinilate (da 1 a 0.015 µg/ml) ed incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Si effettua un confronto con una piastra coattata con Albumina per verificare la specificità del legame.
2. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0,1M PBS pH 7,2 + 0,05% Tween^® 20
3. Aggiungere 100 µl di Streptavidina-POD ( 160 ng/ml) ad ogni pozzetto ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente
4. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0,1M PBS pH 7,2 + 0,05% Tween^® 20
5. Aggiungere 100 µl di TMB ad ogni pozzetto ed incubare per 10 minuti a temperatura ambiente
6. Bloccare la reazione aggiungendo 100 µl di acido solforico 1 N e leggere la densità ottica a 450 nm.