Procedura generale per il legame di una biomolecola al pozzetto coattato con Concanavalina A

1. diluire la biomolecola ( campione) alla concentrazione di 0,5 - 5 µg/ml in un appropriato tampone a pH neutro. Il tampone dovrebbe contenere 1mM Ca⁺⁺ e 1mM Mn⁺⁺ ; infatti questi ioni favoriscono l'interazione dei gruppi zuccherini presenti nella biomolecola con la Concanavalina A.
2. procedere con un'incubazione: i tempi e la temperatura di reazione dipendono dal tipo di biomolecola
3. lavare 4 volte per rimuovere il materiale non legato
4. a questo punto è possibile proseguire il test a seconda delle esigenze dell'esperimento:
• rilevare la biomolecola legata
• utilizzare la biomolecola legata per rilevare una contro molecola specifica

test di valutazione delle piastre coattate con Concanavalina A

1. Preparare delle concentrazioni a scalare da 100 ng/ml fino a 12.5 ng/ml di AHIgG-Pod in una soluzione costituita da 1 mM CaCl₂ 2 H₂O + 1 mM MnCl₂ 4 H₂O in 0.1M sodio fosfato pH 7.2 + 0.2% BSA
2. Aggiungere 100 µl di ogni soluzione ai pozzetti di una piastra coattata con Concanavalina A ed incubare a 37° per 2 ore. Aggiungere le stesse soluzioni ad una piastra coattata con Albumina come confronto per valutare la specificità del legame. Dispensare in alcuni pozzetti solo tampone come blank di reazione
3. Svuotare i pozzetti e lavare 4 volte con 0,1M PBS pH 7,2 + 0,05% Tween^® 20,
4. Aggiungere 100 µl di TMB ad ogni pozzetto ed incubare per 15 minuti a temperatura ambiente
5. Bloccare la reazione aggiungendo 100 µl di acido solforico 1 N e leggere la densità ottica a 450 nm.