Introduzione alla preparazione ed all'uso di superfici amminate per analisi immunologiche

Indicazioni per l'utilizzo

Per legare molecole biochimiche ai substrati amminati vengono comunemente utilizzate differenti metodiche in quanto ogni applicazione richiede una formulazione specifica.

Come indicazione generale si può dire che l'interazione fra il gruppo amminico presente sul micropozzetto ed il gruppo funzionale della molecola che si deve attaccare si basa su legami covalenti mediati da crosslinkers omo ed eterobifunzionali

E' utile sottolineare che l'Etildietilaminopropilcarbodiimide (EDC) con o senza l'addizione di N-Idrossisuccinimide, è un efficace agente legante il gruppo carbossilico della molecola con il gruppo amminico della superficie.

Se la molecola biochimica da legare contiene gruppi amminici della lisina, il metodo più semplice è l'impiego di Glutaraldeide, e conseguente stabilizzazione del legame formatosi attraverso la sua riduzione con Cianoboroidruro. Si possono anche utilizzare composti quali il Dimetilpimelidato ed il Dissucinimidil-suberato per coniugare i gruppi amminici della lisina della molecola al gruppo amminico del micropozzetto.

Una biomolecola contenente gruppi tiolici, come per esempio un Fab-SH o un peptide con cisteina come gruppo terminale, può sfruttare composti contenenti gruppi meleimidici attivi quali Succinimidil-maleimidoetil-cicloesanocarboxilato (SMCC) per interagire con il gruppo amminico.

Superficie biomat NH₂

esempio di schema di reazione:

una biomolecola (R) sotto forma di estere dell'N-idrossisuccinimide (NHS) si combina con la superficie NH₂ tramite la scissione del gruppo NHS

Di seguito sono descritti alcuni esempi di agenti accoppianti che possono essere usati per il legame covalente della superficie biomat NH₂ con gruppi reattivi

A. Disuccinimidil suberato (DSS).
Questo legante simmetrico (omobifunzionale) è in grado di unire composti contenenti ammino gruppi primari o secondari e perciò può essere usato per l'immobilizzo covalente di peptidi, proteine, glicoproteine, lipoproteine

Reazione A

B. Sulfosuccinimidil maleimidometil cicloesano carbossilato (SMCC).
Questo legante eterobifunzionale è in grado di unire composti contenenti gruppi SH. Può essere utilizzato per l'immobilizzo covalente di frammenti di anticorpi Fab-SH o peptidi antigenici con cisteina terminale, esponendo le estremità attive di tali composti alla fase liquida.

Reazione B

C. N-Idrossisulfosuccinimide (Sulfo-NHS) or N-Idrossisuccinimide (NHS) insieme a 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimide Idrocloruro(EDC).
Il legante EDC insieme al Sulfo-NHS o NHS è in grado di unire piccoli peptidi (P.M. circa 1000) attraverso i loro gruppi carbossilici alla superficie attivata NH₂ delle strips

Reazione C

1. peptide
2. Sulfo NHS (o NHS)
3. EDC
4. composto intermedio attivo che risulta dalla reazione
5. superficie biomat NH₂
6. peptide immobilizzato in modo covalente sulla superficie biomat NH₂

Codici dei cross linkers