CARATTERISTICHE FUNZIONALI DELLE STRIP COATTATE CON STREPTAVIDINA

Sono state esaminate le seguenti caratteristiche:

1. capacità legante verso la biotina
2. specificità di legame verso la biotina
3. capacità legante verso le IgG (ed altre macromolecole) biotinilate
4. uniformità del coating
5. prove di stabilità:
1. resistenza ai lavaggi
2. shelf life a 37°C
3. stress da trasporto
4. invecchiamento

1. Capacità legante verso la biotina

Condizioni del test:

I pozzetti coattati con streptavidina (e i controlli saturati con BSA) sono stati incubati con una soluzione calibrata di biotina.
Al termine della reazione, la quota non legata di biotina, insieme a soluzioni standard di biotina, sono state mescolate con perossidasi biotinilata e trasferite in altri pozzetti coattati con streptavidina.
Dalla quantità di enzima legato alla fase solida, si è risaliti al contenuto di biotina nei campioni.
Questo valore è stato confrontato con la quantità di biotina aggiunta all'inizio; dalla differenza fra questi valori ( corretta per i legami aspecifici con i pozzetti di controllo) si è dedotta la capacità dei pozzetti verso la biotina.

Superfici coattate con streptavidina per analisi immunologiche

2. Specificità di legame verso la biotina (metodica 2)

I pozzetti coattati con streptavidina sono stati incubati con soluzioni da 10 a 0.12 ng/ml di perossidasi biotinilata e di perossidasi non biotinilata (blank di reazione) per 30 ' a temperatura ambiente.
Dopo il lavaggio, i pozzetti sono stati incubati con TMB e la reazione è stata bloccata con acido solforico 1N La densità ottica del campione è stata determinata a 450 nm.

Superfici coattate con streptavidina per analisi immunologiche

3. Capacità legante verso le IgG biotinilate (metodica 1)

I pozzetti coattati con streptavidina sono stati incubati con IgG biotinilate (concentrazione da 500 a 0 ng/ml) per 30' a temperatura ambiente.
Dopo il lavaggio, i pozzetti sono stati incubati con AHIgG-Pod per 30' a temperatura ambiente, nuovamente lavati ed incubati con TMB, la reazione è stata bloccata con acido solforico 1N. La densità ottica del campione è stata determinata a 450 nm.

Superfici coattate con streptavidina per analisi immunologiche

4. Uniformità del coating

Condizioni del test:

• una piastra a 96 pozzetti coattata con streptavidina è stata incubata con una soluzione di perossidasi biotinilata.
• dopo il lavaggio, la micropiastra è stata incubata con TMB e la reazione è stata bloccata con acido solforico 1N.
• La densità ottica del campione è stata determinata a 450 nm ed utilizzata per il calcolo del CV%

Superfici coattate con streptavidina per analisi immunologiche

5. Prove di stabilità:

5.1. Resistenza ai lavaggi

La resistenza ai lavaggi è stata valutata seguendo la metodica 1 (concentrazione di IgG biotinilate da 500 a 0 ng/ml), eseguendo il primo lavaggio con i detergenti sottoindicati

Risultati

Contatto con Urea 8M

5.2. Shelf life a 37°C

La stabilità del coating con Streptavidina è stata valutata seguendo la metodica 1 (concentrazione di IgG biotinilate=100 ng/ml), confrontando le micropiastre coattate con Streptavidina mantenute per 15 gg. a 37°C con quelle conservate a 4°C

Risultati

5.3. Stress da trasporto

La stabilità del coating con Streptavidina è stata valutata seguendo la metodica 2, confrontando le micropiastre coattate con Streptavidina sottoposte alle seguenti condizioni:

Risultati

5.4. Invecchiamento

Si sono analizzate con metodica 2 delle piastre coattate con streptavidina conservate per 30 mesi in un magazzino non condizionato (con temperature oscillanti fra i 10°C e i 40°C ) confrontandole con campioni standard conservati a 4°C.
I risultati mostrano l'eccezionale stabilità del coating.

Risultati