1. Attacco del DNA ad un supporto con ammina secondaria

Fosforilazione e marcatura della sonda di cattura
Il DNA usato per il legame mediato dalla carbodiimide è fosforilato all'estremità 5' con T₄ polynucleotide kinase e una parte è radiomarcata con [y-³²P]-ATP per cromatografia su colonna rotante Sephacryl 200 (1 ml) (Pharmacia,Uppsala,Sweden). La concentrazione del DNA è poi misurata per fluorescenza usando il composto Hoechst H33258 (Labarca and Paigen,1980).

La purezza del frammento può essere verificata per elettroforesi in gel di agarosio. Il DNA radiomarcato è mescolato con DNA freddo nel rapporto di 1:10 in modo da ridurre il livello di radioattività negli esperimenti.

L'attacco del DNA
L'attacco covalente del DNA può essere ottenuto per fissazione della sua estremità 5' fosfata sugli amino gruppi attivati della plastica (Zamatteo et al,1996). Le sonde cattura fosforilate per l'individuazione del Cytomegalovirus Umano sono denaturate per 10 minuti a 100° C, raffreddate su ghiaccio (10 min), e diluite in acqua ghiacciata (1.54 ng/µl). Si aggiunge 0.1 M 1-metilimidazolo ghiacciato a pH 7.5 per ottenere una concentrazione finale di 10 mM 1-metilimidazolo. La soluzione di DNA denaturato è dispensata nei micropozzetti (75 µl/pozzetto, 0.7 pmol/pozzetto) operando su ghiaccio. Una soluzione fresca di 0.04 M 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodiimide (EDC) in 10 mM 1-metilimidazolo è aggiunta ad ogni pozzetto (25 µl/pozzetto). Incubare per 5 ore a 50°C.

Dopo l'incubazione, i pozzetti sono lavati tre volte con tampone di lavaggio (0.4 N NaOH, 0.25% Tween^® 20 a 50°C) 200 µl/pozzetto, poi incubati 5 min con tampone di lavaggio, ed infine lavati tre volte ancora . I micropozzetti sono conservati essiccati a 4°C. Dopo il legame, i pozzetti sono frammentati e la quantità di ³²P- DNA legato al pozzetto viene misurata per scintillografia liquida.

2. Attacco di Peptidi ad un supporto con ammina primaria

I peptidi possono essere chimicamente innestati su un gruppo amminico primario attraverso il gruppo tiolico libero di una cisteina incorporata nella loro sequenza usando reagenti eterobifunzionali quali il succinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (SMCC) (Yashida et al,1979: Hashida et al,1984) che può essere acquistato dalla Pierce Chemical (Rokford, USA).

Questo crosslinker consiste di un NHS estere e di un gruppo maleimidico connesso con uno spaziatore. L'estere NHS reagisce con l'ammina primaria, le maleimidi reagiscono con i gruppi sulfidrilici.

L'innesto può essere valutato attraverso un test radiochimico se la tirosina incorporata nella sequenza del peptide è iodinata attraverso un agente ossidante quale la cloramina-T (Greenwood et al,1963). I pozzetti amminati sono incubati in una soluzione 6.5 10-² mM di SMCC in 0.1M tampone fosfato (gli esteri NHS reagiscono con le ammine primarie a pH 7-9) per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo 3 lavaggi con tampone fosfato e 3 lavaggi con acqua, l'innesto è ottenuto incubando i peptidi contenenti cisteina (6.5 µM) overnight a temperatura ambiente in 0.1 M tampone fosfato (le maleimidi reagiscono con i gruppi SH a pH 6.5-7.5). Dopo 3 lavaggi in tampone fosfato, i pozzetti sono frammentati e la quantità di peptide marcato con ¹²⁵I legata è misurata attraverso un gamma counter.

Altri reagenti bifunzionali quali l' N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al, 1978) possono ugualmente essere utilizzati.

Referenze

Carlsson J., Drevin H., Axen R. (1978) Biochem.J. 173, 723-737.
Greenwood F.C., Hunter W.M., Glover J.S. (1963) Biochem. J. 89, 114-123.
Hashida S., Imagawa M., Inoue S., Ruan K.H., Ishikawa E. (1984) J. Appl. Biochem. 6, 56-63.
Labarca C. and Paigen K. (1980) Anal. Biochem. 102, 344-352.
Yoshitake S., Yamada Y., Ishikawa E., Masseyreff R. (1982) J. Biochem. 92, 1413-1424.
Zamatteo N., Giradeaux C., Delforge D., Pireaux J-J., Remacle J. (1996) Anal. Biochem. 236, 85-94.